Key words：Gynostemma total saponin;extracting techniques;orthogonal design
绞股蓝(Gynostemma)为葫芦科绞股蓝属多年生蔓生草本植物,主要含有皂苷、黄酮、多糖,还含有人体必须的多种氨基酸、维生素和微量元素等成分。现代药理学研究表明,绞股蓝具有抑制肿瘤、抗衰老、降低血脂、增强免疫力和保护心脏的作用[1]。绞股蓝总皂苷片作为药品已经上市多年,用于高脂血症,见有心悸气短、胸闷肢麻、眩晕头痛、健忘耳鸣、自汗乏力或脘腹胀满等心脾气虚、痰阻血瘀者。为了最大限度提取并保持绞股蓝的有效成分,保证绞股蓝药材资源的充分利用,提高经济效益,本研究用正交试验优选绞股蓝提取工艺。
1 仪器与试药
UV-2601型紫外分光光度计(岛津);人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所)。冰醋酸、高氯酸、甲醇、香草醛、正丁醇、石油醚等均为分析纯。样品：七叶绞股蓝茎叶混合物,产于四川卧龙地区。
2 方法
2.1 标准曲线的制备[2]
精密称取人参皂苷Rb1对照品10 mg置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为2.0 mg/mL的储备液。精密量取储备液50、100、150、200、250 μL分别置15 mL具塞试管中,挥干甲醇,分别加入新配置的5%香草醛冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸1.6 mL,摇匀,密塞,置60 ℃水浴中加热15 min后取出,立即用冷水冷却至室温,分别精密加入冰醋酸10 mL,摇匀,作为供试品溶液。另精密量取甲醇溶液250 μL置15 mL具塞试管中,按照上述操作,到加入冰醋酸10 mL摇匀为止,作为空白溶液。取供试品溶液和空白溶液,照分光光度法[《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅦA]试验,在560 nm的波长处分别测定吸收度。以人参皂苷Rb1的量X(mg)对吸收度A进行回归,得标准曲线方程为：A=1.275 7X+0.001 9,r=0.998 9。结果表明,当取样量在0.102～0.510 mg范围内时,人参皂苷Rb1的含量与吸收度呈良好的线性关系。
2.2 绞股蓝总皂苷含量测定方法
精密称取绞股蓝总皂苷粉末20 mg置5 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取200 μL置15 mL具塞试管中,挥干甲醇后按“2.1”项下操作,测定吸收度,用标准曲线计算出绞股蓝总皂苷的含量。
2.3 绞股蓝总皂苷的提取工艺
将干燥的绞股蓝药材粉碎成粗粉,准确称量100 g置圆底烧瓶中,用70%乙醇多次回流提取,合并提取液,用旋转蒸发器浓缩后减压干燥,干燥物用1 000 mL的热水充分溶解,加入同体积的石油醚萃取3次,将水层溶液用同体积的水饱和的正丁醇反复萃取,至正丁醇层无色为止,合并正丁醇提取液,用旋转蒸发器浓缩后减压干燥,即得。
2.4 绞股蓝总皂苷提取工艺的正交设计
根据初步试验结果,选用L9(34)正交试验表,以乙醇用量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为试验因素,每个因素取3个水平(见表1)。取样品,按照正交设计进行实验,以绞股蓝总皂苷的提取量为考察指标,进行提取工艺的优选。 表1 正交试验因素水平表(略)
2.5 绞股蓝总皂苷提取工艺的稳定性试验
按照正交试验选择的工艺条件,重复进行绞股蓝总皂苷的提取,并依法测定绞股蓝总皂苷的含量,评价正交试验选择的工艺条件是否稳定。
3 结果
3.1 正交试验结果
按表1的因素水平设计,正交试验结果见表2,方差分析见表3。由表2中极差的直观分析法R值可以看出,因素B的极差0.56为最大,说明它是A、B、C三因素中对绞股蓝总皂苷提取影响最大的因素,其次是因素C,它的极差为0.47,这3个因素对绞股蓝总皂苷提取的影响由大到小的顺序依次为B>C>A。由表3的方差分析结果可以看出,在α=0.1的水平上,B因素和C因素对绞股蓝总皂苷提取有显著性影响,A因素的影响不显著。结合表2和表3的分析可以得出最佳工艺条件为A1B3C3,即药材加8倍量70%的乙醇,回流提取3次,每次2 h,。表2 正交试验结果(略)
3.2 绞股蓝总皂苷提取工艺的稳定性试验结果
为了验证正交试验优选的工艺条件的稳定性,称取3份100 g绞股蓝药材,分别按照最佳工艺条件A1B3C3操作。合并回流提取液,用旋转蒸发器浓缩后减压干燥,干燥物用1 000 mL的热水充分溶解,加入同体积的石油醚萃取3次,将水层溶液用同体积水饱和的正丁醇反复萃取,至正丁醇层无色为止,合并正丁醇提取液,用旋转蒸发器减压干燥浓缩。平行操作,依法测定绞股蓝总皂苷的含量,结果见表4。表3 方差分析表(略)表4 绞股蓝总皂苷提取工艺稳定性试验结果(略)
4 讨论 药学论文发表
本实验以绞股蓝总皂苷提取量为参考指标,对绞股蓝总皂苷的提取工艺进行了优选,优选的最佳工艺条件为A1B3C3。按照最佳工艺条件进行重复性试验,试验结果为：绞股蓝总皂苷的平均提取率为(61.3±0.10)g/kg,RSD=1.64%。结果表明,用该工艺提取有较高的绞股蓝总皂苷提取率,且稳定性良好。因甲醇有害性较大,本实验使用乙醇作为提取介质,有利于减少提取液中的杂质,增加溶出度;采用水浴恒温减压提取,可有效克服高温使绞股蓝总皂苷变性的问题。
【参考文献】
[1] 潘 峰,刘 迪,黄翠霞.绞股蓝总皂苷的药理与临床研究[J].现代中西医结合杂志,2006,15(5)：674-675.
[2] 蒋伟哲,周燕文,李锦桀.广西6种绞股蓝中总皂苷的含量比较[J].药物鉴定,2006,15(3)：26-27.